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　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　失敗、苦悩、人知れぬ努力の末に到達した実験・研究成果の結晶！

 iPS細胞の研究開発を支える！

≪最新≫動物細胞培養の手法と
細胞死・増殖不良・細胞変異を防止する技術

●溶存酸素、温度、pH、浸透圧、静圧のコントロールのコツ！

●剥離・分散用溶液、抗生物質溶液等の最適な添加方法は？

●適切な培地選択で栄養不足、酸化ストレスを回避する！

●付着、浮遊細胞、幹細胞の大量培養プロセスの効率化

●iPS細胞からの分化制御法

●大量生産、低コストを実現する細胞培養装置の設計！

●がん化／アポトーシスの測定、細胞の活性・増殖測定、 接着力解析、培養組織の柔らかさ測定の手法は？

●「少ないスペース」、「効率よく」　を可能にする三次元培養、生体組織の環境に近い培養基材の最新研究事例！

●細胞の凍結保存、解凍、輸送の仕方！！

1節　継代作業の製品別の取り扱い手法
1. 細胞および培養条件
1.1 培地
1.2 細胞の維持
1.3 細胞の倍加時間
2. RAW264.7細胞の継代
2.1 播種
2.2 継代

2節　浮遊状態の細胞の培地交換手法と培養特性
1. 培地交換に適した培養装置と操作法
2. 回分培養と灌流培養の培養特性
3. 凝集した細胞に対する培地交換の影響
3.1凝集したrCHO細胞のG-CSF生産に対する培地交換の有効性8)
3.2 凝集した軟骨細胞に対する培地交換の影響

3節　細胞治療・再生医療における継代培養
1. 継代培養の目的と操作
1.1 継代培養の目的
1.2 継代操作
1.3 継代操作の簡易化と自動化
2. 継代培養における細胞挙動と評価パラメータ
2.1. 細胞接着と細胞分裂
2.2 一連の継代培養中における接着能と増殖能の変化
2.2 種々のドナーに由来する角化細胞の寿命

［1］ 培地の選択
1. 基礎培地の選択
2. 添加剤の選択
2.1 血清の選択
2.1.1 各血清の特徴
2.1.2 血清の問題点と対策
2.2 血清代替品の選択
3. 培地選択における細胞死・細胞凝集･増殖不良対策
3.1 pH変化への対策
3.2 浸透圧変化への対策
3.3 酸化ストレスへの対策
3.4 栄養不足に対する対策
3.5 シェアストレスへの対策
3.6 その他

［2］　動物細胞の無血清培養におけるリン脂質の利用
1. CHO細胞に及ぼすPAの効果
2. PAの供給方法

［3］　高性能な無血清培養液の開発とその応用
1.無血清培養液について
1. 1　血清は含まないが、生体由来の機能性成分を含む培養液（Serum Free Medium, SFM）
1. 2　血清も生体由来成分を含まず、組替えタンパク質を含む培養液（Animal Derived Factors Free Medium, ADF）
1. 3　化学的に組成が明確である培養液（Chemically Defined Medium, CDM）
2.無血清培養液の利用分野
2. 1　細胞・再生医療分野における無血清培養液
2. 2　生物医薬品生産分野における無血清培養液

［4］　基礎培地の最適化
1. 基礎培地の種類
1.1 MEM培地（Eagle最少必須培地）
1.2 DMEM培地（ダルベッコ改変イーグル培地）
1.3 RPMI1640培地
1.4 その他の培地
2. 基礎培地の調製方法
2.1 粉末培地
2.2 液体培地
2.3 各種成分の添加
3. 基礎培地の選定方法
3.1 細胞の接着
3.2 細胞の増殖
3.3 細胞の分化

［1］　細胞剥離・分散用溶液の最適な添加手法
1. 細胞接着
2. 生体内での細胞接着固定
3. 生体外での細胞接着固定
4. 継代培養における細胞の剥離・分散
5. 初代培養における細胞分散
6. まとめ

［2］ 抗生物質溶液の最適な添加手法
1. コンタミの判断
1.1 バクテリア
1.2 カビ
1.3 酵母
1.4 マイコプラズマ
1.5 細胞どうしのコンタミ
2. 抗生物質
2.1 ペニシリンG
2.2 アンピシリン
2.3 ストレプトマイシン
2.4 カナマイシン
2.5 ネオマイシン
2.6 ゲンタマイシン
2.7 アンフォテリシンB
2.8 マイコプラズマ除去剤
3. 抗生物質溶液の添加手法
3.1 抗生物質溶液の作成
3.2 培地への抗生物質添加
3.3 培養細胞への抗生物質添加
3.4 コンタミからの救済措置
3.5 マイコプラズマの除去

［3］ 物質生産・組織再生に有効な細胞凝集培養
1. 代謝産物生産・組織再生に対する細胞凝集の有効性
1.1 rCHO細胞の凝集培養とG-CSF生産性
1.1.1 積極凝集法
1.1.2 自然凝集法
1.2 軟骨細胞の自然凝集と組織再生

［4］　グルタミンによる細胞維持・増殖調節機構
1. 生体におけるグルタミンの機能
2. グルタミンはコレステロール合成酵素の発現を亢進する
3. グルタミンはSREBPの発現及び活性を亢進する

［5］　魚由来血清の応用と実用化
1　魚血清の細胞接着阻害
2　魚血清の熱処理と低濃度添加の接着細胞増殖促進効果
3　魚血清中の脂質の接着細胞増殖に与える影響
4　魚血清を用いた動物細胞浮遊培養
5　今後の課題

［6］　動物細胞培養用の再生培地添加剤による増殖不良対策
1. 再生培地添加剤の調製法
2. マウスハイブリドーマを利用した抗体生産系における再生培地添加剤の使用効果
3. CHO細胞を利用した抗体生産系における再生培地添加剤の使用効果
4. まとめ

［7］　細胞培養過程における抗体凝集抑制　 〜ケミカルシャペロン：トレハロースの影響〜
1．トレハロース含有培地を用いた抗体産生CHO細胞の培養
2．トレハロース添加による細胞培養過程における抗体凝集の抑制
3．トレハロース添加細胞培養の今後の課題と展望

［1］ マリンコラーゲンを用いた動物細胞の培養
１．足場材料の重要性
２．足場材料の安全性
３．株化細胞および初代細胞に対するクラゲ由来コラーゲンの効果
４．ヒト幹細胞の無血清培養技術へのクラゲ由来コラーゲンの応用
4.1　ヒト間葉系幹細胞(hMSCs)の無血清培養技術への応用
4.2　ヒト多能性幹細胞(hPSCs)の無血清培養技術への応用

［2］ 動物細胞培養担体としてのヒドロキシアパタイト
１．ヒドロキシアパタイト
２．チャイニーズハムスター卵巣細胞
３．初代肝細胞
４．造血幹細胞

［3］ コラーゲン改質技術による細胞培養基板の構築
1. コラーゲン基板の多様性
1.1 ２次元培養基板
1.1.1 コート
1.1.2 表面修飾
1.1.3 線維ゲル
1.2 スポンジ状培養基板（２．５次元）
1.3 ３次元培養基板
2. 細胞培養基板をつくる新しいコラーゲン改質技術
2.1 硬さを制御した２次元培養用コラーゲンゲル
2.2 スポンジの緻密化と力学特性の向上
2.3 ３次元培養用コラーゲン線維ゲルの緻密化法
2.4 液性因子透過性コラーゲンゲル膜
2.5 細胞輸送用キャリア

［4］　細胞培養用アパタイトシートを用いた動物細胞の３次元培養技術
1.細胞培養用アパタイトシート
1.1　アパタイト・パルプ複合体繊維とアパタイトシート
1.2　細胞培養用アパタイトシート
2.細胞培養用アパタイトシートを用いた動物細胞の３次元培養
2.1　培養ディッシュでの静置培養
2.2　高密度３次元連続培養
2.2.1　細胞培養モジュール
2.2.2　連続培養装置

［5］　コラーゲンビトリゲル膜チャンバーを用いた細胞培養システム
1.生体内の疑似環境を提供する理想的な培養担体の条件
2.理想的な培養担体：コラーゲンビトリゲル膜
3.化学物質の毒性・動態解析に有用な理想的な培養モデル
4.理想的な培養器具：コラーゲンビトリゲル膜チャンバー
5.化学物質の毒性・動態解析に有用な培養システム
5.1　ヒト角膜上皮モデルを用いた眼刺激性試験法（Vitrigel-EIT method）
5.2　ヒト角膜上皮モデルを用いた角膜透過性試験法（Vitrigel-CPT method）
5.3　ヒト肝実質モデルを用いた肝代謝・毒性試験法（Vitrigel-LMTT method）
6.今後の展望

［6］　多孔質膜上での３次元培養
1.生体内と同じ細胞培養系の必要性
2.いままでの細胞培養の問題点
3.３次元細胞培養の種類。
4.膜培養の要件
5.インサートから酸素透過性96ウェルプレートへさらに384ウェル、1536ウェルプレートへ
6.これからの膜培養―ハイコンテントアナリシスへの応用

［7］　再生医療に用いられる適切な細胞足場の選択とその評価法
１．生体吸収性合成高分子の多孔質足場材料及びその生体吸収性の評価
２．生体吸収性天然高分子の多孔質足場材料
2.1. 生体吸収性天然高分子からなる多孔質足場材料の作製
2.2. 生体吸収性天然高分子の多孔質足場材料を用いた組織再生
３．複合多孔質足場材料
3.1. 複合多孔質足場材料の作製
3.2. 複合多孔質足場材料を用いた軟骨細胞の培養と再生軟骨の評価
４．脱細胞マトリックス多孔質足場材料
4.1. 複脱細胞マトリックス多孔質足場材料の特長
4.2. 培養細胞由来のマトリックス多孔質足場材料

［8］　カーボンナノチューブ薄膜上での細胞培養
1.カーボンナノチューブ薄膜の作製
2.カーボンナノチューブ薄膜上での細胞培養
2.1　カーボンナノチューブ薄膜上での一般的な細胞培養
2.2　細胞培養における培地の影響
2.2.1　基材への培地プレインキュベート条件
2.2.2　血清濃度の影響
2.2.3　培地の種類による影響

［9］　生体に近い細胞培養法：３次元環境と反重力刺激の融合
1.細胞培養法の歴史と培養法の一般論
1.1　細胞培養の歴史
1.1.2　培地の標準化
1.1.3 フィーダー層の開発
1.1.4 立体（3次元）細胞基盤
1.1.5 動力学培養装置
1.2　細胞育成と組織再建に必要な５大要素
1.2.1　細胞
1.2.2　細胞外マトリックス（ECM）
1.2.3　栄養供給
1.2.4　制御因子
1.2.5　動力学要素
1.3　細胞外マトリックス（ECM）の属性と機能
2.人工細胞外マトリックスの幾何学
2.1　幾何構造の重要性
2.2　細胞培養基盤（人工ECM）の幾何構造の分類と実例
2.2.1　最適3次元空間の追究―最初の努力：　ReddiとHugginsの閉管モデル
2.2.2　血管阻止幾何構造
2.2.3　血管確保幾何構造による直接骨形成
2.2.4 骨形成の最適ポアサイズはハバース 系の直径に近い
2.2.5 トンネル構造内での細胞の挙動
2.2.6 全方向ランダムトンネル構造体28)
2.2.7 チャンバー型スキャフォールド29)
2.2.8　コラーゲン線維の方向性を誘導する膜　
2.2.9 チタン細線維による3次元構造（チタンウエブ、ＴＷ）
3.動力学要素と3次元空間の融合
3.1　立体（３次元）培養には動力学要素が必要：生体により近い培養へ
3.2　これまでに開発された動力学装置
3.2.1　圧縮刺激と伸展刺激
3.2.2　ズレ応力
3.2.4　重力の効果：微小重力装置
3.2.5 動力学要素と3次元細胞基盤との複合　
4.最も基本的で簡易で反重力培養装置
4.1　基本原理
4.2　装置の構造
4.3　反重力培養法の成果
4.3.1　反重力培養による重力効果の推定
4.4　結論

［10］　ナノファイバー複合体を活用した細胞足場の開発と評価
1. 電界紡糸
2. バイオ系高分子の電界紡糸
3. 電界紡糸不織布の生分解性評価
4. ドライスピニング
5. バイオマテリアルへの応用例

［11］　 ナノコンポジット型ヒドロゲルを用いた細胞培養基材の開発と評価
１．PNIPAナノコンポジット(N-NC)ゲル
1.1. Ｎ−ＮＣゲルの細胞培養性
1.2. 温度応答性による細胞剥離
２．共重合ナノコンポジット(MD-NC)ゲル
2.1. ＭＤ−ＮＣゲルの特性
2.2. ヒト間葉系幹細胞の培養
３．ソフトナノコンポジット(M-NC)
3.1. Ｍ−ＮＣの特性
3.2. 細胞培養と剥離

［12］　 高分子表面のプラズマ処理による細胞培養基板の機能化設計と開発
１．ポリスチレンへのプラズマ表面処理
２．プラズマ表面処理を利用したポリスチレン培養基板の表面機能化
2.1. プラズマ表面処理を利用したポリスチレン基板表面へのカルボキシル基導入法
2.2. VEMAC固定化ポリスチレン表面のペプチド機能化

［13］　金属材料を用いた細胞足場の開発と評価・課題
1. 細胞培養基材としての金属材料の特殊性
1.1 不透明性
1.2 表面酸化物（不動態皮膜）
1.3 試料準備
2. 細胞適合表面の創出
2.1 表面処理の分類
2.1.1 ドライプロセス
2.1.2 ウェットプロセス
2.2 化学組成改良の効果
2.3 表面粗さの効果
2.4 生体機能分子被覆の効果
2.5 表面形態の効果
3. 足場材料としての課題

［14］　 ケラチンを用いた高機能細胞培養足場の開発・評価
１．羊毛ケラチンを用いた細胞足場
1.1. 羊毛ケラチンの抽出と特性
1.2. ケラチン多孔体
1.2.1　凍結乾燥ケラチン多孔体16）
1.2.2　圧縮成形と食塩ポロゲンにより作製したケラチン多孔体17）
1.2.3　アルギン酸カルシウムビーズをポロゲンに使った凍結乾燥ケラチン多孔体18)
２．ケラチンの化学修飾による高機能化細胞足場
2.1.ケラチン／リン酸カルシウム複合化多孔体19）
2.2.骨形成因子（ＢＭＰ−２）によるケラチン多孔体の修飾20）

［15］　細胞非接着ポリマーにより微細加工した培養器による三次元培養
1.初代肝細胞三次元培養のための培養器の開発
1.1　初代肝実質細胞の三次元培養
1.2　細胞非接着ポリマーにより微細加工した培養器の開発
2．培養条件の検討
2.1　培地組成の検討
2.2　フィーダー細胞との共培養
2.3　凍結ヒト初代肝細胞の選択
3.培養方法
3.1　凍結ヒト初代肝細胞の融解
3.2　初代肝細胞の播種
3.3　維持培養
4.アプリケーションへの応用

［16］　 生態組織の物性環境を模倣したアクリルアミドゲル基板培養方法
１．アクリルアミド培養基質の利点
２．適切な足場の物性条件
３．細胞にとっての周辺環境の物性とは

［17］　 再生医療用　軟骨細胞培養における三次元培養技術とその評価
1 再生軟骨の問題点
2 再生軟骨構築の試み

［18］　 マイクロカプセルを利用した細胞凝集体の成長制御と大量培養
1. 細胞包括中空マイクロカプセル
2. 鋳型ゲルビーズ
　2.1 ゲルビーズ材料
　2.2 ゲルビーズ作製法
3. カプセル皮膜
　3.1 皮膜材料
　3.2 皮膜作製法
4. 中空構造の効果と細胞凝集体の成長制御
5. 大量生産性

［19］　 足場材料・細胞培養材料の開発例〜配向連通多孔型足場材料〜
1．細胞培養技術と足場材料
2．足場材料に求められる設計要件
3．配向連通型足場材料の提案

［1］ 供給ガスを槽内に効率的に溶解させる通気撹拌槽とその利用法
1.気液流動 および 気泡から液中へのガス溶解
1.1　通気撹拌槽（培養槽）
1.2　気液流動
1.2.1　撹拌速度と通気量の影響
1.2.2　通気方法の影響
1.2.3　撹拌翼形状の影響
1.3　気泡から液中へのガス溶解
2.数値解析技術を用いた培養槽設計と運転条件選定
2.1　培養槽の数値解析手法の概要
2.2　培養槽の数値解析結果の例
2.2.1　数値解析対象と計算格子
2.2.2　気液流動・ガス溶解・せん断応力の数値解析結果
2.2.3　細胞培養の数値解析結果

［2］ インキュベーターの特徴と動物細胞培養における効果的な利用法
1. インキュベーターの特徴
1.1 インキュベーターに求められる能力
1.2 インキュベーターの構造
1.3 ウォータージャケット型とダイレクトヒート型
1.4 チャンバー内の温度と湿度
1.5 各センサーの種類と特徴
1.5.1 温度センサー
1.5.2 CO2センサー
1.5.3 O2センサー
1.6 オプション品について
1.6.1 集塵フィルター
1.6.2 小扉
1.6.3 ガスガードシステム
2. インキュベーターの使用とメンテナンス
2.1 インキュベーターの設置場所
2.1.1 空調設備を備えた室内
2.1.2 出入り口から離れた場所
2.1.3 空調の風が直接当たらない場所
2.1.4 専用架台の上または床面から距離をとる
2.2. インキュベーター使用時の留意点
2.2.1 ガス濃度の確認
2.2.2 加湿水の確認
2.2.3 チャンバー内の清掃
3. これからのインキュベーター
3.1 ドライインキュベーター（バッグ培養）
3.2 ドライインキュベーター（体外受精）
3.3 培養細胞モニタリングシステム

［3］ 大量生産・低コストを実現する中空糸型細胞培養装置
1.中空糸型自動細胞培養システムの構成
1.1　構成
1.2　特徴
2.浮遊系細胞培養モジュール
2.1　浮遊系細胞モジュールの設計
2.2　浮遊系細胞モジュールの性能
3.接着系細胞培養モジュール
3.1　接着系細胞培養モジュールの設計
3.2　接着系細胞培養モジュールの性能
4.自動細胞培養装置

［4］　ラジアルフロー型バイオリアクターを用いた三次元培養
　 〜細胞・足場材料（スキャホールド）・バイオリアクターによる三次元組織の構築〜
1. 組織再生の足場としてのアパタイトファイバースキャホールド（AFS）
1.1 AFSの作製およびその微細構造
1.2 AFSの細胞浸潤性
2. ラジアルフロー型バイオリアクター(RFB)
3. AFSを装填したRFBによる未分化間葉系幹細胞の三次元培養
3.1 AFSを装填したRFBによるRBMCの三次元循環培養
3.2 再生培養骨の分化レベルの検証

［5］　バッグ型シングルユースバイオリアクターを活用した細胞培養技術
１．シングルユースバイオリアクター
1.1　 WAVEバイオリアクター
1.1.1 kLaの比較
1.1.2 培養例
1.2　 Xcellerex培養装置

［6］　国産シングルユース培養槽、バッグとその利用
1. 医療における動物細胞培養シングルユース技術
2. 製薬における動物細胞培養シングルユース技術
3. シングルユース細胞培養技術の問題点

［7］　培養装置による動物細胞の大量培養
1. 動物細胞の大量培養
2. 大量培養における培養環境の制御
2.1 培養温度
2.2 培地供給（培地交換）
2.3 培地pH
2.4 溶存酸素濃度
3. 大量培養装置
4. 酸素消費速度の測定による細胞の活性評価
5. 大量培養のための高密度細胞凍結法
5.1 凍結法
5.2 解凍・接種法

［8］　細胞の培養、保存、運搬、に用いるステンレス表面処理技術

［9］　多層フラスコを活用した培養空間の有効利用
１．培養システムの選択ポイント
1.1. 細胞の接着性に応じた培養システム
1.2. 細胞あるいは生産物の目標収量に合わせた培養システムの選択
1.3. 必要な設備やスペースの検討
1.4. 作業者の確保
1.5. 技術への投資や作業の効率化
2．多層フラスコの利用
2.1. フラスコ
2.2. 多層フラスコ
2.2.1　3層あるいは5層の多層フラスコ
2.2.2　特殊構造の多層フラスコ
2.2.3　生産レベルの培養規模にも対応した多層フラスコ

［10］　小スケールの培養装置・システムの開発例とその応用
1. スクリーニングあるいは小スケール生産用途のバイオリアクター
　1.1 全容250mLバイオリアクター
　1.2 マウスES細胞の培養例
　1.3 ヒトiPS細胞の培養例
2. スケールアップ培養用途のバイオリアクター
　2.1 全容３Lバイオリアクター
　2.2 マウスES細胞の培養例
3. 培養工程のオンラインリアルタイムモニタリング
　3.1 静電容量によるオンライン生細胞数計測

［11］　オゾンUV 処理したポリマーにおける細胞培養
1. ポリマー表面処理法とその諸性質
　1.1 オゾン−UV 処理
　1.2 オゾン−UV 処理ポリマーの赤外線スペクトル
　1.3 表面処理したポリマー表面のぬれ性（接触角の測定）
2. オゾンＵＶ処理した各ポリマーの生体親和性
　2.1 表面改質したポリマーへのタンパク質吸着
　2.2 オゾン-UV 処理を行った各ポリマーへの細胞接着

［12］　閉鎖型自動培養装置による間葉系幹細胞の培養
１．閉鎖型自動培養装置P 4C Sの概要
1.1 培養装置のコンセプト
1.2 閉鎖型培養システム
２．閉鎖型自動培養装置P 4C Sの主要な機能
2.1. 培養操作
2.1.1. 細胞播種操作
2.1.2. 培地交換操作
2.1.3. 再播種操作
2.1.4. 細胞回収操作
2.2. 細胞観察
2.3. 履歴管理
３．間葉系幹細胞の培養
3.1 準備
3.2 培養方法
3.3 培養実績

［1］ 動的力学刺激によるヒトiPS細胞の培養・分化制御法
1.実験細胞の準備
2.動的力学刺激付加システム
2.1　超小型3次元振動ステージの概要
2.2 力学刺激付加実験手法
3.ヒトiPS細胞コロニー培養への動的力学刺激の影響
4.ヒトiPS細胞の神経系細胞への分化に及ぼす動的力学刺激の影響

［2］ フェムト秒レーザー誘起衝撃力を用いた培養動物細胞の高精度スクリーニング
１．レーザーの波長、強度、時間幅による細胞に誘導される現象制御
２．フェムト秒レーザー誘起衝撃力
３．単一細胞の選択剥離
４、おわりに

［3］ 電気を利用した動物細胞の付着･剥離･継代のコントロール
1　動物細胞の電気制御培養装置
2　定電位印加による細胞外マトリクスタンパク質の剥離
3　定電位印加による動物細胞の空間配置制御
4　電位印加による動物細胞の剥離および継代の制御
5　電位印加による電極基板上からの動物細胞剥離のメカニズム
6　おわりに

［4］　培養細胞への伸展刺激負荷装置
1.生体内における細胞への物理的刺激
2.伸展刺激に対する培養細胞の応答
3.伸展刺激負荷のための細胞培養装置
4.細胞伸展刺激負荷培養マイクロデバイスの開発例

［1］ 細胞組織評価のための培養シミュレーションシステムとその利用法
1.足場依存性細胞培養における細胞挙動
1.1　個別細胞挙動に対する解析方法
1.1.1　細胞接着に対する解析
1.1.2　細胞増殖に対する解析
1.1.3 個別細胞挙動の観察
1.2　個別細胞面積に基づく接着挙動の評価
1.3　接触阻害を考慮した増殖挙動の評価
2.細胞挙動解析に基づく細胞増殖能シミュレーション
2.1　個別細胞の世代時間と集団細胞の倍化時間
3.個別細胞挙動解析にも基づく培養シミュレーション

［2］ 培養細胞の誘電率を利用した細胞活性の測定
1. 誘電泳動
1.1 誘電泳動理論
1.2 誘電泳動浮揚法
2. 測定装置および方法
3. 誘電泳動を用いた細胞活性解析
3.1 増殖活性と誘電特性Re[K(ω) ]の関係
3.2 分化活性と誘電特性の関係
3.3 誘電泳動による連続分離法

［3］ 動物細胞培養の増殖測定
１．直接計数法
　１．１　血球計算盤による方法
　　１．１．１　目視計測（マニュアル計測）
　　１．１．２　自動計測
　　１．２　コールター原理による方法
２．間接計数法
　２．１　生理活性を利用する方法
　２．１．１　細胞内酵素活性を利用して測定する方法
　　２．１．１．１　MTT法
　　２．１．１．２　水溶性のホルマザンを生成するテトラゾリウム塩を用いる方法
　２．１．２　細胞の飲作用を利用して測定する方法（ニュートラルレッド法）
　２．２　細胞核染色法

［4］　自家培養における細胞・培養評価技術
1.免疫細胞療法における自家培養
1.1　免疫細胞療法における培養特性
1.2 抗体刺激培養評価
1.3 増殖培養評価
1.4 自家培養での培養特性評価

［5］　 ナノニードルを用いた細胞接着力解析技術
１．ナノニードルによる細胞操作
1.1. ナノニードル
1.2. ナノニードルの侵襲性と細胞操作
２．細胞の接着力測定方法
2.1. AFM探針による細胞の垂直剥離
2.2.強接着細胞の接着力の測定
2.3.細胞の接着力と運動性の関係

［6］　細胞の培養と培養組織の柔らかさの測定評価例
1. 初代培養
　1.1 上皮細胞と線維芽細胞
　　1.1.1 初代培養explant culture
　1.2 上皮細胞の大量培養法
2. 三次元培養
　2.1 三次元培養法
　2.2 生体外歯周炎モデルの構築
　　2.2.1 生体外歯周炎モデルによる薬剤のスクリーニング
　2.3 線維芽細胞像
3. 三次元培養組織の柔らかさ計測
　3.1 軟組織の柔らかさ柔さ計測
　　3.1.1 柔らかさを数値化する計測
　　3.1.2 触診テクニックに基づいた柔さ計測
　　3.1.3 触診を模擬した押込試験法
　3.2 三次元培養組織の弾性係数の計測例
　　3.2.1 コラーゲン分解を阻害する生薬のスクリーニング
　　3.2.2 押込試験システムの汎用化への展開

［7］　光音響イメージング顕微鏡での3次元培養細胞観察
１．はじめに
２．光音響イメージング
２．１　光音響現象とイメージング装置の概略
２．２　励起用レーザーと生体の光学特性
２．３　超音波トランスデューサーと光音響イメージングの空間分解能
２．４　光音響イメージング法の種類
３．光音響イメージング顕微鏡を用いた研究報告
３．１　核酸を光吸収体とした光音響イメージング
３．２　メラニン色素を光吸収体とした光音響イメージング
３．３　色素を光吸収体とした光音響イメージング
３．４　カーボンや金を光吸収体とした光音響イメージング

［8］　細胞移植治療における心筋細胞の精製・移植方法と、生着率の評価法
１．多能性幹細胞由来心筋細胞の最もシンプルな精製方法
1.1. 乳酸法の概略
1.2. 乳酸法の成果
２．心筋細胞の生着率向上への取り組み、その評価方法
2.1.効率的移植法の開発
2.2.ボール法の概略
2.3.ボール法の成果
３．心筋細胞の生着率の評価方法
３.１.組織学的計測方法
3.2.遺伝子標識のＰＣＲによる定量化
3.3. 生体イメージング手法（１）：ルシフェラーゼ発現による発光細胞の検出
3.4　生体イメージング手法（２）：金属ラベルのＭＲＩによる検出
3.5. 生体イメージング手法（３）：ＲＩラベルした細胞のガンマーカメラによる検出
3.6. 生体イメージング手法（４）：量子ドットによる近赤外線蛍光観察法
3.7. 生体イメージング手法（５）：thymidineリン酸化酵素の遺伝子導入と基質投与によるＰＥＴ解析

［9］　がん研究領域のための細胞培養観察
1.長期間培養と細胞形態の画像解析
1.1　安定した培養空間
1.2　細胞に対する低侵襲な観察技術
1.3　自動化技術
1.4　画像解析
2.がん研究領域に利用されるアプリケーション事例の紹介
2.1　形態分類解析例
2.2　トラッキング解析例

［1］ 培養系を用いた細胞の形質転換・細胞がん化の判定法
1. 正常細胞
2. がん細胞とがん化
3. がん化の評価に適した細胞

［2］ 培養細胞における酸化ストレスとアポトーシスの測定
１．酸化ストレスの評価法
1.1. CellROXを用いた培養細胞における活性酸素の局在に関する評価
1.2. cytochrome C還元法を用いた好中球の活性酸素産生に関する評価
1.3. 抗カルボキシメチルリジン抗体を用いたタンパク質の糖酸化修飾に関する評価
２．アポトーシスの評価法
2.1. Hoechst33342とPIを用いた同時二重染色による生死細胞の評価
2.2. 蛍光標識Annexin�Xを用いたアポトーシスの評価

［3］ 動物の癌化細胞株の樹立と特性解析
1. 腫瘍組織の摘出と組織病理の解析
2. 悪性腫瘍組織からがん細胞の分離と培養
3. 細胞株が悪性腫瘍を形成することの検証
4. 細胞株の特性解析

［1］ フィーダーシステムによる多能性幹細胞の未分化維持技術
はじめに
１.　フィーダー細胞の役割
2．　遺伝子改変フィーダー細胞による未分化維持培養
2.1.　遺伝子導入フィーダー細胞による細胞−細胞間相互作用の強化
2.2.　液性因子を分泌する遺伝子導入フィーダー細胞
3．　人工フィーダー/フィーダーフリーによる未分化維持培養

［2］　ヒトiPS細胞自動培養装置の開発とその利用
はじめに
１．自動培養装置の仕組み
1.1　搬入口
1.2　操作部
1.3　インキュベータ
1.4　細胞観察装置
1.5　細胞回収と出庫
２．細胞の継代におけるパラメータ設定
３．iPS細胞の自動培養の今後

［3］　幹細胞の大量培養プロセスの効率化の検討
1.全能性幹細胞の実用化における大量培養の重要性
2.全能性幹細胞の大量培養のための浮遊懸濁培養
3.アルギン酸カルシウムゲルを用いたカプセル化培養の実際
3.1　カプセル化の利点
3.2　細胞のカプセル化
3.3　異なる形式のカプセルによるマウスiPS細胞の培養
3.4　初期播種密度と増殖
3.5　未分化維持性
4.まとめと今後の課題・展望

［4］　ニワトリの胚性幹細胞研究と培養技術
1. 胚盤葉細胞の分離方法
　1.1　受精卵
　1.2　胚盤葉上層の分離
2. 分離した胚盤葉上層の培養方法
　2.1　支持細胞のワーキングストックの準備
　2.2　支持細胞の準備
　2.3　胚盤葉上層細胞の初代培養
　2.4　胚盤葉上層細胞の継代培養

［5］　物理的環境が細胞培養に与える影響と細胞の増殖・分化制御・培養技術
1.　物理的刺激に対する細胞応答
　1.1　重力
　　1.1.1　骨芽細胞の培養例
　　1.1.2　骨芽細胞と破骨細胞の培養例
　　1.1.3　筋芽細胞の培養例
　1.2　磁場
　　1.2.1　骨芽細胞の培養例
　　1.2.2　筋芽細胞の培養例
　1.3　電気
　1.4　超音波
2.　幹細胞培養技術への利用
　2.1　微小重力での幹細胞培養
　2.2　電気刺激による神経分化誘導

［6］　電気化学を用いた細胞脱離技術
1. 電気化学を用いた細胞脱離
　1.1 細胞脱離の原理
　1.2 細胞接着性オリゴペプチドの設計
　1.3 細胞脱離に要する時間
2. 細胞シート、スフェロイドの作製と脱離
　2.1 細胞シートの脱離と積層化
　2.2 粒形の均一なスフェロイドの作製と回収
3．電気化学細胞脱離を利用した血管様構造の作製
　3.1 血管様構造の作製
　3.2 血管様構造の三次元配置

［7］　培養基材と多能性幹細胞培養
はじめに
1.基材に基質を被覆する場合
1.1 ゼラチン被覆
1.2 マトリゲル被覆
1.3 MPC被覆
1.4 PEG被覆
1.5 ITO膜
2．基材そのものを加工し利用する場合
2.1 セラミック基材
2.2 ファイバー基材

［8］　幹細胞の培養・分化・アッセイ用デバイス開発
はじめに
1.幹細胞培養方法と３次元培養容器
2.培養容器とメソドロジー紹介
2.1　マイクロウェル内培養法：「Micro Sphere Array」
2.2　マイクロウェル内培養法で形成された３次元球状細胞塊の特長
2.3 神経幹細胞のSingle Cell Culture
2.4 幹細胞の接着・分化誘導法：｢Spheroid　Migration　Chip｣
2.5 分化誘導後の薬剤アッセイとイメージング
3.おわりに

［9］　培養温度による動物細胞の分化制御
初めに
1.　骨格筋細胞の分化に対する低温の影響
1.1　低温環境では筋分化が抑制される
　1.1.1　低温における筋管形成
　1.1.2　MyoD, myogeninとその他の転写調節因子の発現変化
　1.1.3　筋分化制御に関与するマイクロRNAの発現変化
1.2　低温での筋分化をレスキューする条件の探索
　1.2.1　IGF-IとビタミンCよる30℃での筋分化促進作用
　1.2.2　38℃で分化させた細胞の培養上清による30℃での筋分化促進作用
　1.2.3　分化培養液のウマ血清濃度と低温における筋分化抑制作用の関係
1.3　ヒト由来骨格筋細胞株
1.4　トランスジェニックマウスを用いた単一筋線維培養
2.　骨格筋細胞の分化に対する高温の影響
3.　その他の組織の細胞分化に対する温度の影響

［10］　網膜組織への分化誘導、組織の培養における条件の設定
初めに
1. 内在性幹細胞による両生類での網膜組織への分化誘導
2. 薬剤投与による鶏胚の網膜の培養
2.1 網膜の層形成を誘導する因子Wnt-2b
2.2 組織細胞の分化・脱分化・分化転換の研究
3. ヒト及びマウスの網膜幹細胞の浮遊培養
3.1 虹彩及び毛様体色素上皮由来網膜幹細胞
3.2 網膜色素上皮由来網膜幹細胞
3.3 胎児網膜由来網膜幹細胞
4. マウスES細胞由来眼様構造の誘導
4.1 PA6ストローマ細胞上でのマウスES細胞からの眼様構造の誘導
4.2 マウスES細胞からの次元的な眼胞の誘導
5. 成体マウス網膜の組織培養
6. ヒトES及びiPS細胞由来網膜細胞及び眼様構造の誘導
6.1 ヒトiPS細胞から網膜細胞への分化誘導接着培養法
6.2 PA6ストローマ細胞上でのヒトES細胞からの眼様構造の誘導
6.3 ヒトES細胞から立体網膜の形成

［11］　　歯の再生研究に有用な器官培養、歯胚再構築法
はじめに
1.歯胚の摘出と器官培養
1.1　装置・器具・試薬
1.2　方法
2.Semi-solid mediumを用いた歯胚再構成法
2.1　装置・器具・試薬
2.2　方法

［12］　唾液腺研究における組織培養・分化誘導系
1. 胎仔唾液腺の器官培養系
1.1　試薬・材料
　1.1.1　培地
　1.1.2　血清
　1.1.3　解剖用具
　1.1.4　培養器材
1.2　器官培養法
2.　HSG細胞による腺房細胞分化誘導系
2.1　試薬・材料
　2.1.1　培地
2.1.2　血清
　2.1.3　培養器材
2.2　腺房細胞分化誘導系
3．成体耳下腺の器官培養系
3.1　実験法
3.1.1　材料
　3.1.2　準備
3.1.3　培養（マウス耳下腺の組織培養例）
3.2　検証
3.3　実験例
3.4　他の組織の培養

［13］　心筋細胞の分化誘導と条件の設定
はじめに
1. ES/iPS細胞からの心筋分化誘導
1.1　胚様体形成を用いた分化誘導法
1.2　心筋分化を促進するシグナル
2.心筋分化誘導プロトコール
1.1　分化初期
1.2　分化中期
1.2　分化後期

［14］　肝組織の培養における条件の設定とシステム開発
はじめに
１．胎仔の肝臓原基の器官培養
２．肝組織のin vitro 器官形成培養
３．肝組織の再構築培養

［15］　腎臓組織幹細胞の分離・培養と腎臓再生
はじめに
1.label-retaining cell とSlow cycling cell
2.腎臓SP細胞
3.rKS56細胞
4.Tissue Engineeringの応用
5.胚盤胞補完法

［1］ 変異育種による培養特性の改善
1. 不均衡変異導入法とは
2. 不均衡変異導入法による高品質な突然変異体ライブラリー
2.1 高い突然変異頻度（図2A）
2.2 多様な突然変異種（図2B）
2.3 低い細胞毒性（図2C）
3. 細胞育種事例
3.1 CMTによる培養環境への適応
3.2 TMTによる増殖性の改善

［2］ 効率的なmRNA核外輸送系を用いたタンパク質生産法
１．はじめに
２．真核細胞におけるタンパク質生産過程
３．ウイルスの仕組みを利用したタンパク質発現系の効果
４．発現系の構築と動物細胞での発現
５．おわりに

1節　ヒトiPS細胞等幹細胞培養の実際と維持管理
はじめに
1. ヒトiPS細胞の培養方法
1.1. フィーダー培養
1.1.1 iPS細胞フィーダー培養のポイント
1.2 フィーダーレス培養
1.3 浮遊培養
1.4 iPS細胞の品質管理
1.4.1 未分化能の維持
1.4.2 多能性の維持
2. iPS細胞培養液の現状
3. iPS細胞の維持管理と今後の課題
3.1 パッセージについて
3.2 浮遊培養について
4. 最後に

2節　現場における微生物汚染対策
1.手指の消毒
2.無菌操作に必要な装置・器具
2.1　クリーンベンチ
2.2　滅菌方法
3.コンタミネーションの概略
3.1　カビ
3.2　酵母　　
3.3　細菌
3.4　マイコプラズマ
3.5　異なる細胞間のコンタミネーション

3節　細胞培養方法の標準化手法
1. バラツキの要因
2. 培養方法の標準化
　2.1 標準作業手順書等の作成
　2.2 細胞の凍結保存及び保管
　2.3 教育訓練の実施

4節　培養の設備・器具の管理のポイント
はじめに
１．培養室の設計に当たって
２．昆虫などへの対策
３．清掃
４．防災対策
５．機器および器具
５．１　ガスバーナー
５．２　炭酸ガスインキュベータ
５．３　倒立顕微鏡
５．４　冷凍冷蔵庫
５．５　超低温冷凍庫と液体窒素容器
５．６　吸引（サクション）ライン
５．７　プラスチック・ガラス器具

5節　細胞の凍結保存・輸送方法の留意点
はじめに
１．細胞の凍結保存
1-1. 細胞の凍結に用いる器具・試薬・機器
1-2.細胞の凍結方法
1-3.細胞の保存方法
２．細胞の輸送方法
2-1. 凍結細胞の輸送方法
2-2. 培養状態の細胞発送
2-3. 生物資源の輸送に関する注意点　

6節　動物細胞工程　スケールアップ時における廃棄物・環境保全対策
はじめに
1. 動物細胞培養の特徴
2. 培養残渣
3. 動物細胞
4. 培養液
5. 精製工程から出る異物
6. 残渣処理の目的
7. 製造現場の管理
8. 微生物の存在
9. 培養環境
10. 作業員と管理
11. 危機管理
12. 法規制等の順守

7節　細胞品質管理のための細胞画像情報解析を用いた客観的評価法
はじめに
3.1　細胞形態情報に基づく線維芽細胞の増殖収量予測
3.1.1実験材料および方法
3.1.2　結果
3.2　細胞形態情報に基づく間葉系幹細胞の骨分化度予測
3.2.1実験材料および方法
3.2.2　結果
おわりに

8節　 細胞培養作業における無菌性の確保とアイソレータの活用　
〜製薬での製造施設の実例を交えて〜
1．無菌医薬品の製造工程
　1.1 アイソレータを用いた製造工程
　1.2 アイソレータ設備の維持管理
2．再生医療製品の製造工程
3．再生医療への展開とまとめ

1節　ヒトの不死化細胞株の樹立と特性解析
はじめに
1. ヒト正常細胞における継代培養と分裂加齢
1.1 ヒト正常細胞の培養
2. ヒト正常細胞からの不死化細胞の樹立
2.1 ヒト正常細胞へのTERT遺伝子導入と培養
2.2 不死化細胞株の樹立
3. 不死化細胞株の特性解析
3.1 テロメラーゼ活性
3.2 テロメア長測定
3.3 分化形質の維持・分化マーカーの遺伝子発現
3.4 老化関連β-gal染色
3.5 軟寒天培地コロニー形成法
3.6 核型解析
4. 超長期寿命化細胞系の樹立とその意義
おわりに

2節　霊長類ES/iPS細胞の凍結保存・輸送・解凍
はじめに
1 霊長類ES/iPS細胞の性質と凍結保存の現状
2 ドライアイス輸送を考慮した霊長類ES/iPS細胞用凍結保存液の開発
3 ROCK阻害剤を用いた霊長類ES/iPS細胞の凍結保存
4 今後に向けて

3節　細胞の大量培養，品質管理，保存に関する注意点
はじめに
1. 細胞の大量培養
1.1 付着細胞の大量培養
1.2 浮遊細胞の大量培養
1.3 付着細胞の攪拌による大量培養
1.4 培養細胞を大量に増やす場合の注意点
1.4.1 培養液
1.4.2 細胞増殖の確認
2. 品質管理
2.1 培養に関する注意事項
2.1.1 無菌操作
2.1.2 培養する際の注意
2.2 感染に関する注意事項
2.2.1 マイコプラズマ汚染
2.2.2 ウイルス検査
2.3 細胞の由来に関する注意事項
3. 保存
3.1 細胞の保存の意義・方法
3.2 保存に関する注意事項
3.3 融解に関する注意事項
3.4 凍結細胞の確認
4. バンクでの大量培養

1節　再生医療製品の品質関連規制と対応の留意点
はじめに
1. 再生医療における薬事法改正と新法案
1.1　薬事法の改正案
1.2　再生医療等の安全性の確保等に関する法律案
2. 再生医療に係わる通知・指針等
2.1　ヒト幹細胞を用いる臨床研究
2.2 「細胞・組織利用医薬品等の取扱い及び使用に関する基本的考え方」
2.3　ヒト（自己／同種）由来細胞や組織を加工した医薬品又は医療機器の品質及び安全性の確保に関する指針
2.4　ヒト幹細胞加工医薬品等の品質及び安全性確保に関する５指針
おわりに

2節　バイオ医薬品（組換えタンパク質医薬品）の品質関連規制と対応の留意点
はじめに
1.バイオ医薬品の製造に用いられる細胞基材
2.バイオ医薬品の品質関連規制　
2. 1　バイオ医薬品の品質管理に関するガイドライン
2. 2　バイオ医薬品の品質管理
2. 2．1　特性解析　
2.2.2　重要品質特性の選択と許容範囲設定
2.2.3　品質管理戦略の構築
3. バイオ医薬品の品質管理における細胞培養関連の留意事項
3.1 原材料の管理
3.1.1遺伝子発現構成体
3.1.2　セル・バンク
3.1.3　培地，及び，培地添加物
3.1.4 生物由来原料基準への適合性
3.2　工程パラメータ管理
3.3　工程内管理試験の設定
3. 4　ウイルス安全性
3.5　製造方法の変更前後での同等性／同質性評価
おわりに

1節　動物細胞培養工学において知っておくべき特許の知識
１．はじめに
２．発明の概念
３．発明の特許要件
４．発明の特許要件：産業上利用可能性
５．発明の特許要件：新規性，進歩性等
６．先願主義
７．特許出願手続
８．明細書の記載要件及び記載上の注意点
９．特許請求の範囲の記載要件及び記載上の注意点
１０．特許権の効力
１１．外国での権利取得
１２．最後に

2節　日本での細胞培養特許に関する審査基準と今後とるべき対応
１．発明の把握とカテゴリー
１．１　発明のカテゴリー
１．２　細胞培養技術と発明の把握
１．３　把握した発明の表現（特許請求の範囲の記載）
２．特許要件と審査基準
２．１　特許要件
２．２　審査基準
　２．２．１　発明該当性（特許法２９条１項柱書）
　２．２．２　産業上利用可能性（特許法２９条１項柱書）
　２．２．３　新規性（特許法２９条１項各号）
　２．２．４　進歩性（特許法２９条２項）
　２．２．５　サポート要件（特許法３６条６項１号）
　２．２．６　実施可能要件（特許法３６条４項１号）
　２．２．７　発明の単一性（特許法３７条）
３．今後とるべき対応
３．１　最新判例の実務へのフィードバック
　３．１．１　発明該当性
　３．１．２　サポート要件
　３．１．３　新規性
　３．１．４　進歩性
　３．１．５　実施可能性要件
　３．１．６　その他
３．２　より効果的に権利取得をするために

3節　米国での細胞培養特許に関する審査基準と今後とるべき対応
はじめに
1．グローバル戦略における米国実務の重要性
2．米国特許実務
2．1　ラボノート〜己を知る
2．2　敵を知る〜情報開示制度（IDS）
2．3　グレースピリオド〜先発明者の保護の思想
3．米国のバイオ実務
3．1　動物細胞関連の特許主体適格性
3．2　有用性の問題―情報開示、実験データの開示の程度
3．3　改正法の適用
4．まとめ

4節　拒絶されない明細書・クレームの記載のコツ
はじめに
１．動物細胞培養と特許
２．発明の認定
2.1　本願発明の認定
2.1.1　基本的な考え方
2.1.2　留意事項
2.2　引用発明の認定
2.2.1　基本的な考え方
2.2.2　留意事項
３．特許請求の範囲の作成
3.1　特許請求の範囲の記載要件
3.1.1　サポート要件
3.1.2　明確性の要件
3.1.3　特許請求の範囲作成上の留意点
４．明細書の作成
4.1　明細書の記載要件
4.1.1　実施可能要件
4.1.2　生物材料の寄託制度
4.1.3　明細書作成上の留意点
おわりに

5節　中間処理のコツ
はじめに
１．中間処理とは
1.1　中間処理の種類
1.2　中間処理の内容
1.3　中間処理の基本的な留意事項
２．中間処理の基本的方向性
2.1　中間処理における提出書類
2.2　補正書の留意事項
2.2.1　時期的制限
2.2.2　内容的制限
2.3　意見書、実験報告書等の留意事項
３．中間処理の具体的対応
3.1　新規性・進歩性に関する中間処理
3.1.1　新規性欠如への対応
3.1.2　進歩性欠如への対応
3.2　記載要件に関する中間処理
3.2.1　サポート要件違反への対応（特許法36条6項1〜2号）
3.2.2　実施可能要件違反への対応（特許法36条4項1号）
3.2.3　進歩性との関係
３．出願人と審査官の意思疎通
おわりに

6節　留意すべき検索ワード
はじめに
1. 検索ワード選択の考え方
1.1 水平展開（バリエーション）
1.2 垂直展開（上位概念化）
2. 特許文献で用いられている用語の具体例
2.1 細胞
2.1.1 細胞の種類
2.1.2 細胞の性質
2.2 培養基材
2.3 細胞に作用する因子
2.4 細胞に対する処理
3. 特許文献との対比における考え方
3.1 クリアランス調査
3.2 特許性に関する先行技術調査
4. まとめ

7節　特許分析から見る動物細胞培養の研究開発のトレンド
はじめに
1. 動物細胞の培養
1.1 「動物細胞の培養」とは
1.2 特許分類
1.3 特許分析から見る動物細胞培養の研究開発トレンド
1.3.1 基礎技術　　
1.3.2 応用技術
1.3.3 培養装置関連技術
おわりに